經(jīng)典實(shí)驗(yàn)步驟是將提取的蛋白電泳—轉(zhuǎn)膜 --- 一抗孵育 --- 二抗孵育 --- 底物顯色 --- 分析。我這幾天幾乎都在重復(fù)著這個(gè)過(guò)程，現(xiàn)在將自己試驗(yàn)過(guò)程記錄下來(lái)，和大家一起分享，希望對(duì)新手有所幫助。

1.蛋白提取

     傳統(tǒng)方法是(1)組織稱(chēng)重(2) 利用液氮、研缽粉碎組織塊(3) 加入RIPA緩沖液，PMSF(4)勻漿（15,000轉(zhuǎn)/分*1分鐘）維持4℃(5)加入PMSF冰上孵育30分鐘，移入離心管4℃ 離心15分鐘(6)上清液為細(xì)胞裂解液可分裝-20℃保存。一部分進(jìn)行Bradford比色法 測(cè)定蛋白質(zhì)濃度， 取相同質(zhì)量的細(xì)胞裂解液（體積*蛋白質(zhì)濃度）進(jìn)行電泳。

    小結(jié) 現(xiàn)在有許多公司提供即用的蛋白提取試劑或者試劑盒，如生興生物 代理的Pierce系列產(chǎn)品，針對(duì)不同動(dòng)物組織、真核等蛋白的提取試劑盒，以及RIPA緩沖液，PMSF等即用型試劑，免去了復(fù)雜繁瑣的提取過(guò)程，高效方便。

2. 蛋白電泳(SDS-PAGE)

(1) SDS-PAGE凝膠配制

    SDS-PAGE凝膠可以參考一些文獻(xiàn)資料進(jìn)行配制，也可以使用現(xiàn)成的SDS-PAGE凝膠配制試劑盒

(2) 樣品處理

    在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(2X或5X的)?？梢宰孕信渲?。

(3) 上樣與電泳

    這一步主要是要注意電泳的電壓選擇和蛋白標(biāo)準(zhǔn)的選擇，為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，最好使用預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn) 。

3. 轉(zhuǎn)膜

    具體的轉(zhuǎn)膜時(shí)間要根據(jù)目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越長(zhǎng)，目的蛋白的分子量越小，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越短。實(shí)驗(yàn)中常選用PVDF膜和硝酸纖維素膜(NC膜)，但硝酸纖維素膜比較脆，推薦使用PVDF膜。轉(zhuǎn)膜的效果用麗春紅染色液或者考馬斯亮藍(lán)快速染色液對(duì)完成轉(zhuǎn)膜的SDS-PAGE膠進(jìn)行染色，以觀察蛋白的殘留情況。

    小結(jié)   PVDF膜 及Western轉(zhuǎn)膜液 質(zhì)量都比較好，染色液的染色結(jié)果清晰，便于觀察結(jié)果，所以推薦在試驗(yàn)中使用。

4. 封閉

    這一步一定要保濕，避免膜的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。加入Western封閉液封閉(脫脂奶粉 或者BSA)。一般采用BSA或者脫脂奶粉，建議最好使用BSA或?qū)Ｓ玫拿撝谭圻M(jìn)行封閉，雖然貴點(diǎn)，但還是有個(gè)好點(diǎn)的結(jié)果比較好。

5. 一抗孵育

    參考一抗的說(shuō)明書(shū)，按照適當(dāng)比例用Western一抗稀釋液稀釋一抗

6. 二抗孵育

    參考二抗的說(shuō)明書(shū)，按照適當(dāng)比例用Western二抗稀釋液稀釋辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗。

7. Westernblot 試劑盒顯色及蛋白檢測(cè)

    參考相關(guān)說(shuō)明書(shū)，使用相應(yīng)的熒光檢測(cè)試劑等ECL類(lèi)試劑來(lái)檢測(cè)蛋白。洗片時(shí)可以使用X光片自動(dòng)洗片機(jī)。如果沒(méi)有自動(dòng)洗片機(jī)，可以用顯影定影試劑盒 自行配制顯影液和定影液進(jìn)行手工洗片。

8. 膜的重復(fù)利用

    如果蛋白樣品非常寶貴，可以使用Western一抗二抗去除液處理蛋白膜，以重復(fù)利用蛋白膜。

9. 分析比較記錄

主要試劑：丙烯酰胺和N，N’-亞甲雙丙烯酰胺、十二烷基*SDS溶液、濃縮膠緩沖液、TEMED原溶液、SDS-PAGE加樣緩沖液、Tris-甘氨酸電泳緩沖液、轉(zhuǎn)移緩沖液、麗春紅染液儲(chǔ)存液、脫脂奶粉、NaN3 0.02% 疊氮鈉、Tween20、一抗、標(biāo)記二抗、NBT、BCIP、100mmol/LTris-HCL(pH9.5)、100mmol/L NaCl、50mmol/LTris-HCL(pH7.5)、5mmol/L EDTA等。