綿羊作為全球畜牧業(yè)關鍵畜種，其繁殖效率及生殖細胞質量直接關聯(lián)產業(yè)經濟效益。近年來，天然活性物質白藜蘆醇與褪黑素在動物生殖領域備受矚目。白藜蘆醇具強抗氧化、抗炎效能，能調節(jié)細胞內多條信號通路；褪黑素于晝夜節(jié)律調控及自由基清除作用突出，二者于綿羊細胞及卵母細胞層面潛在價值亟待深挖，本研究應運而生。
綿羊卵巢采集自當?shù)赝涝讏?，離體 2 小時內送達實驗室，于預冷生理鹽水中保存，用于卵母細胞采集。
細胞系選用綿羊成纖維細胞，由實驗室前期分離培養(yǎng)并凍存，復蘇后傳代至對數(shù)生長期用于實驗。
白藜蘆醇、褪黑素標準品購自藥企，純度超 98%，以二甲基亞砜（DMSO）配制成母液，工作液現(xiàn)用現(xiàn)配，確保 DMSO 終濃度低于 0.1%，排除其干擾。
細胞實驗分對照組、白藜蘆醇低劑量組（1 μmol/L）、白藜蘆醇高劑量組（10 μmol/L）、褪黑素低劑量組（100 nmol/L）、褪黑素高劑量組（1 μmol/L）及聯(lián)合用藥組（白藜蘆醇 1 μmol/L + 褪黑素 100 nmol/L），每組設 6 個復孔。
卵母細胞實驗依相同劑量梯度分組，每組至少 30 枚卵母細胞，重復 3 次，確保樣本代表性。
細胞處理：將綿羊成纖維細胞接種于 96 孔板，培養(yǎng) 24 小時貼壁后換液，分別加入含不同藥物濃度培養(yǎng)基，孵育特定時長（24、48、72 小時），對應時間點檢測細胞活性、氧化應激指標等。
卵母細胞操作：采用機械法結合酶解法獲取卵丘 - 卵母細胞復合體，經體外成熟培養(yǎng)體系預平衡后，加入藥物處理，培養(yǎng) 24 小時觀察成熟率，后續(xù)行孤雌激活評估早期胚胎發(fā)育潛能，記錄卵裂、囊胚形成數(shù)據(jù)。
細胞活性以 CCK - 8 法測定，吸光度值間接反映存活細胞數(shù)量；細胞凋亡借 Annexin V - FITC/PI 雙染流式細胞術分析，精準量化凋亡比例；活性氧（ROS）水平用 DCFH - DA 熒光探針標記，熒光強度與 ROS 呈正相關。
卵母細胞成熟依第一極體排出判定，成熟率 = 排出第一極體卵母細胞數(shù) / 總卵母細胞數(shù) ×100%；胚胎發(fā)育潛能觀察卵裂期胚胎數(shù)量及囊胚形成率，囊胚率 = 囊胚數(shù) / 卵裂胚胎數(shù) ×100%。
細胞活性：與對照組相較，白藜蘆醇及褪黑素各劑量組處理 48 小時后顯著提升綿羊成纖維細胞活性（P < 0.05），聯(lián)合用藥組增幅尤為突出，高劑量白藜蘆醇單藥效果次之，表明二者具協(xié)同促增殖潛能。
抗氧化能力：藥物處理組 ROS 水平呈劑量依賴性降低，褪黑素高劑量組 72 小時降幅達 45%，白藜蘆醇組亦有效抑制氧化應激，聯(lián)合組 ROS 清除效率超 60%，同時抗氧化酶（SOD、CAT）活性增強，維持細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)。
抗凋亡表現(xiàn)：流式結果顯示，處理組凋亡細胞比率顯著減少，白藜蘆醇通過激活 PI3K/Akt 通路抑制線粒體途徑凋亡，褪黑素則上調抗凋亡蛋白 Bcl - 2，聯(lián)合用藥近乎消除早期凋亡峰，全方面守護細胞存活。
體外成熟：白藜蘆醇與褪黑素顯著加速卵母細胞成熟進程，高劑量組成熟率較對照組提升約 18%（P < 0.05），聯(lián)合用藥使成熟時間提前約 2 小時，皮質顆粒分布更均勻，預示受精能力增強。
胚胎發(fā)育：經孤雌激活，處理組卵裂率及囊胚率大幅改善，褪黑素助力早期卵裂，白藜蘆醇促進囊胚形成及內細胞團增殖，聯(lián)合組囊胚發(fā)育至孵化階段比例明顯增加，胚胎質量顯著優(yōu)化，為后續(xù)胚胎移植奠基。
本研究揭示白藜蘆醇與褪黑素協(xié)同賦能綿羊細胞及卵母細胞。在細胞體系，二者多靶點協(xié)作，抗氧化防線穩(wěn)固，抗凋亡網絡致密，從分子層面保障細胞功能完整性，為綿羊體細胞保存、基因編輯供體優(yōu)化提供新思路；于卵母細胞，不僅成熟效率飆升，胚胎發(fā)育全程護航，直擊畜牧繁育關鍵節(jié)點，有望革新綿羊輔助生殖策略，從源頭提升種群繁殖力，然具體分子對話機制及長期應用安全性尚待深挖，后續(xù)研究可期。
白藜蘆醇與褪黑素單用及聯(lián)用對綿羊細胞及卵母細胞裨益顯著，可作天然高效生物添加劑用于綿羊繁殖產業(yè)，經精準劑量調配與應用場景拓展，有望重塑綿羊養(yǎng)殖經濟效益版圖，為畜牧科技進階注入活力，助力產業(yè)綠色、高效、可持續(xù)發(fā)展征程。后續(xù)宜聚焦體內驗證及產業(yè)化轉化關鍵技術攻堅，促科研成果落地生根。
